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血液总RNA提取试剂 Serum Total RNA Extraction Reagent TRIzol R1040
  • 品  牌:

    普利莱
  • 货  号:

    R1040
  • 规格ml:

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描述:血液总RNA提取试剂特别加强了对液体标本如全血等RNA的提取能力。直接将液体标本与血液总RNA提取试剂混合即可,极大简化了样品的提取前处理过程。并且其提取能力强大,甚至可以从已经凝固的血液块中提取出高纯度的RNA。使用方法与RNAtrip TRIzol相似,可在3060分钟内完成。获得高纯度总RNA可用于RT-PCRNorthern BlotRNA酶保护、Poly(A) mRNA纯化、体外翻译等实验。

储存:4oC密封避光保存一年以上有效。

适用:液体标本(200µl/ml): 全血、体液、尿液,悬浮细胞、病毒微生物样品等。

效果展示:

图:血液RNA提取试剂(R1040)提取的大鼠全血总RNA

操作准备:

极微量的RNA酶都会导致RNA降解。RNA酶污染主要来自以下五个方面:(1) 来自实验人员的双手。(2) 来自器皿、吸头离心管、自备液体。(3) 组织细胞破碎不可避免地释放内源RNA酶。(4) RNA未能完全与蛋白质分离。(5) RNA沉淀和溶解时来自吸头离心管和溶液。我们的Step by Step质量监测表明,RNAtrip LS试剂可100%抑制内源性和实验用品引入的外源RNA酶污染,并在随后的分离步骤极为有效地清除蛋白包括RNA酶。因此在有RNAtrip LS存在的情况下高压消毒30分钟的吸头离心管和溶液,可以胜任RNA提取操作。然而,一旦离开RNAtrip LS试剂的保护,如在沉淀和溶解步骤,来自吸头离心管和液体的RNA酶污染可能导致RNA降解。因此在这些步骤应严格使用高压消毒用品。戴手套无疑是有益的,但戴口罩和帽子则无必要。只要严格按照本指南进行准备和操作,使用RNAtrip LS试剂总是能获得完整的高纯度总RNA。这里描述的仅是针对血液总RNA提取试剂的实验准备方案,对其它来源RNA提取试剂未做全面检查

1. 高压蒸汽30分钟消毒一次性吸头离心管。RNA沉淀和溶解之后,应严格使用高压消毒的一次性用品。然而RNAtrip LS能在RNA酶污染环境下工作,在裂解步骤可使用未高压但洁净的一次性吸头和离心管,但仅推荐在紧急情况下这样做。由于不可预测的原因,如动物已经处死,组织已取出,细胞已收取,而吸头和离心管尚未高压处理。这仅适用于RNAtrip LS试剂,对其它来源RNA提取试剂无效。此时保险做法是使用普利莱公司的组织RNA保护液(Cat# R1030),把来不及处理的标本保存在RNA保护液中,25 oC保存2周,4 oC保存4周,-20 oC保存数月,标本中RNA不会降解。

2. DEPC处理的双蒸水。加DEPC到水中至终浓度为0.01% v/v,室温过夜,高压消毒30分钟。用于溶解RNA,配制TE缓冲液和75%乙醇。

3. 普通双蒸水。高压消毒30分钟,用于冲洗器皿,配制琼脂糖凝胶和电泳用缓冲液。注意溶液配制后高压灭菌,但琼脂糖不能高压处理。

4. 冰盒和湿冰。在冰上进行操作有助于减少RNA降解。

5. 异丙醇,氯仿,纯乙醇,分析纯。75%乙醇用高压消毒的蒸馏水配制。

6. 其它用品电泳槽,双蒸水冲洗。离心机和加样器,无需处理。

7. 戴手套。注意某些实验如提取质粒DNA使用大量RNA酶,为防污染须特别清洗实验器具和实验区域。

RNA提取程序

液体标本:全血、体液、尿液,悬浮细胞、病毒微生物样品等。每200ml液体样品加1 ml RNAtrip LS,置冰上。未抗凝的凝固血液按固体组织处理。

1. 将裂解物转移到1.5 ml离心管,置冰上10分钟。如需暂停操作,裂解物可冻存于-70 oC至少一个月。

2. 加入0.2体积的氯仿(0.2ml),充分颠倒混匀,冰上孵育15 分钟,溶液开始分相。有时分相不明显,不影响提取。

离心12,000g 4 oC 10 分钟,溶液分为两相。RNA保留于上层无色透明水相约0.6ml,下层为有机相,两相界面是一层薄膜其厚度与组织细胞类型和多少有关。小心吸出上层水相转移到新离心管,但应留0.51 mm厚水相,以免扰动和吸入下面的碎片和无机相。如吸入无机相和碎片,应将所取水相放回管中并重新离心10分钟,再吸取水相。这一点至关重要,违背此原则容易导致RNA降解和DNA污染。

3. 加入等体积异丙醇(0.5ml)于含有上清的新离心管中,充分混匀。冰上孵育10 分钟绰绰有余。但-20 oC 放置一至数小时,可回收几乎所有的RNA。如需尽可能多的RNA,或起始组织细胞的量很少,或用户需要暂停操作时,可以这样做。用更低的温度和更长的时间进行沉淀并不必要。

4. 离心, 12,000g4 oC10分钟。小心弃上清,管底可见少许黄白色RNA沉淀。如初始组织细胞量少,RNA沉淀用肉眼几乎难辨,但不影响实验。

5. 洗涤沉淀。立即加入1 ml 75%乙醇,颠倒混匀数次,12,000g 5分钟。弃上清,尽量吸去管壁上的液体。乙醇洗涤后RNA沉淀容易漂浮,勿倒掉RNA沉淀。此时可将RNA沉淀保存在75%乙醇中,4 oC一周或-20 oC一年。

6. 敞开管口空气干燥5-10分钟,RNA沉淀干燥至胶冻状即可。过分干燥将使RNA难以溶解。用50-100 ml DEPC处理的高压消毒纯水或TE溶解沉淀。如RNA难溶,可55 oC加热10分钟,或反复冻融数次助溶。RNA溶液可保存于-70 oC或液氮中;或加3倍体积乙醇-20 oC冻存,用时离心沉淀。

7. 测定OD值。计算RNA浓度和OD260/280比值。RNAtrip LS提取的RNA绝少蛋白污染,比值通常在1.62.0之间均属正常。OD260/280比值受很多因素影响。起始组织量过大或RNAtrip LS试剂过少,或吸取了有机相或碎片,将使OD260/280比值降低,应预以避免;RNA用水溶解或pH偏酸OD260/280偏低,而用TE或离子强度较高的溶液溶解时该比值较高,但均不影响RNA使用。用户应该知道,即便是已降解的RNA,该比值也能达到看似完美的2.0左右,因此该比值并非判断RNA降解与否的指标。可进行RNA琼脂糖电泳检查RNA完整性(见说明2)

说明:

1. 测定OD,根据OD260计算RNA浓度。OD260/280比值可初步判断RNA质量,比值在1.6-2.0之间均属正常。起始组织量过大,或吸取了有机相或碎片,将使RNA样品中蛋白和杂质含量高,RNA沉淀乙醇洗涤不充分(步骤8),均可导致OD260/280比值降低。例如,RNA用水溶解或pH偏酸OD260/280偏低,用TE或离子强度较高的溶液溶解时较高,但均不影响RNA后续使用。切记即便是已降解的RNAOD260/280比值也能达到看似完美的2.0左右,因此该比值并非判断RNA降解与否最佳的指标。判断RNA质量的最佳途径是进行普通RNA琼脂糖电泳检查RNA完整性。

2. 检查RNA完整性。取1 mg RNA样品进行11.5%普通琼脂糖凝胶电泳。溴化乙锭染色,紫外灯观察。28S RNA~5 kb亮度应该约为18S RNA~2 kb的两倍,有时可见0.10.3 kb 5S RNA

3. 调整RNA溶液的体积或重沉淀RNA(1) 加入适量DEPC处理过的高压消毒纯水或TE缓冲液,于RNA溶液中,使溶液体积补齐到约400 ml(2) 加入 0.1 体积的3M 醋酸钠 pH 5.2,混匀;(3) 加入2.5体积的纯乙醇,混匀;(4) 冰上孵育10 分钟;(5) 12,000g 4 oC 离心10 分钟,弃上清;(6) 执行上述RNA提取程序的步骤68

4. RNAtrip LS勿直接接触皮肤和吸入。如接触皮肤,立即用大量水清洗。

5. 可连续提取蛋白质和基因组DNA,可向普利莱基因公司索要说明书。

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