活性氧ROS检测试剂盒（红色荧光）  C1300-2

描述：

本试剂盒利用荧光探针DHE进行活性氧检测。DHE可自由透过活细胞膜进入细胞内，在细胞质中呈蓝色荧光，被细胞内的ROS氧化后形成氧化乙啶掺入染色体DNA中，使细胞核呈现明亮的红色荧光。在激发波长535nm，发射波长610nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测荧光强度，测定细胞内活性氧水平。具有背景低、灵敏度高、线性范围宽、使用方便等优点，是一种快速简便的组织或培养活细胞中ROS经典检测方法。

适用范围：

贴壁细胞、悬浮细胞、新鲜动物组织

工作波长：

激发波长480-535nm，最佳发射波长590-610nm

组成：

0.2ml, 5mM DHE，-20 ºC避光保存 一年有效

所需设备：流式细胞仪、荧光酶标仪、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计等

操作步骤：

一、 细胞样本：

1. 收集细胞，进行活性氧测定

1.1 细胞收集：悬浮细胞：2000rpm，离心5min，收集沉淀，用0.01M PBS或无血清培养液洗涤2次，1000rpm，离心5min，弃上清，取细胞沉淀；贴壁细胞：吸去培养液，用0.01M PBS或无血清培养液反复吹打，使细胞层全部进入PBS或培养液中，收集细胞悬液，用0.01M PBS或无血清培养液洗涤2次，1000rpm，离心5min，弃上清，取细胞沉淀；

1.2加入DHE探针：用稀释好的DHE荧光探针重悬细胞沉淀，一般情况下，细胞密度要求1*10⁶-2*10⁷/ml，推荐探针初始工作浓度为10 µM（DHE工作浓度可在1µM~100 µM范围内，需进行预实验确定最适浓度）。

1.3 37 ºC孵育细胞10分钟~90分钟。通常情况下，10-30分钟即可。注意：孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DHE浓度等有关。可以每隔5min颠倒混匀一下，使探针与样本充分接触。

1.4 1000g，离心5min，去上清收集细胞沉淀，用PBS缓冲液洗涤2次，重悬细胞。

1.5 进行荧光检测，以荧光度数值表示结果。

2. 不收集细胞，直接将探针加入培养基测定

2.1 加入DHE探针：去除细胞培养基上清，加入用无血清培养液稀释好的DHE探针（推荐探针终浓度为10 µM），加入探针的体积以能盖住细胞为宜，通常6孔板单孔不少于500 µl。

2.2 37ºC孵育细胞10分钟~90分钟。通常情况下，10-30分钟即可。注意：孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DHE浓度等有关。可以每隔5min颠倒混匀一下，使探针与样本充分接触。

2.3 弃去上层培养液，用0.01M PBS或无血清培养液洗涤2次，去除未进入细胞内的探针。

2.4 进行荧光检测，以荧光度数值表示结果。

二、 动物组织样本

1.1 细胞悬液制备：可采用单细胞悬液制备仪或传统的组织处理方法如：酶解法、研磨法等制备单细胞悬液；

1.2 加入DHE探针，加入DHE探针：去除细胞培养基上清，加入用无血清培养液稀释好的DHE探针（推荐探针终浓度为10µM）。

1.3 37ºC孵育细胞10分钟~90分钟。通常情况下，10-30分钟即可。注意：孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DHE浓度等有关。可以每隔5min颠倒混匀一下，使探针与样本充分接触。

1.4 1000g，离心5min，去上清收集细胞沉淀，用PBS缓冲液洗涤2次，重悬细胞

1.5 进行荧光检测，以荧光度数值表示结果。

注意事项：

（1）开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集于管底，避免开盖时染液损失。

（2）要设有无DHE孵育的对照，即不加探针，只用0.01M PBS重悬的细胞。

（3）荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，以避免背景升高。多次清洗时注意操作规范，避免将细胞洗掉。

（4）对于药物处理（孵育）时间较短的细胞（2小时以内、也有建议4小时以内），可以先用荧光染料进行标记，后用药物刺激细胞后。对于药物处理时间较长的细胞（超过4小时或6小时以上），建议先用药物处理（刺激）细胞，后用探针标记。

（5）DHE在光照和空气中易被氧化，保存和操作中应注意避光。

（6）对不同的细胞和组织，应选择合适的孵育时间和浓度，以观察ROS的变化。

（7）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。