描述：钙黄绿素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶 (PI) 可分别对活细胞和死细胞染色，用于同时对活细胞和死细胞进行荧光染色分析。Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490nm, Em=515nm），在传统的Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。进入细胞后，Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂如BCECF-AM和CFDA相比，Calcein, AM细胞毒性极低，是最适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时     观察活细胞和死细胞。而用545 nm激发，仅可观察到死细胞。 试剂盒经过优化，单次可进行200µl细胞悬液染色。

规格：500次

组成及保存：

Calcein-AM Solution（2mM） 50μL   -20°C 避光干燥保存

PI Solution（2 mM） 150μL   -20°C 避光干燥保存

一年有效

操作步骤：

1. 工作液的配制

1）先将低温保存的 Calcein-AM 溶液 (2 mM)和 PI 溶液（2 mM）平衡至室温。

注意：第一次使用可对母液进行分装，以减少反复冻融次数。

2）取5µl Calcein-AM 溶液 (2 mM)和 12.5µl PI 溶液（2 mM）至 5ml 1xPBS缓冲液（pH 7.4），充分混匀。 得到 Calcein-AM 的工作液浓度2μM，PI 的工作液浓度5μM。

由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定 Calcein-AM 和 PI 的最适浓度。梯度筛选的原则为 使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。

注意：由于 Calcein-AM 的稳定性比较差，此染色工作液必须现配现用，且在当天用完。

2. 染色步骤

2.1 贴壁细胞，先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA消化细胞，离心收集细胞（1000 rpm，3min）。

悬浮细胞，直接离心（1000 rpm，3min）收集细胞。

2.2 去上清，用 1xPBS缓冲液（pH7.4）洗涤细胞2~3次，去除残留的酯酶活性。

注意：由于培养基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM遇水会分解，导致空白上升，所以需要数次离心，用PBS洗涤数次直到完全洗净。

2.3 制备细胞悬液，使其密度为 1×10 5~1×10 6细胞/ml。

2.4 取100µl染色工作液加入200µl细胞悬液内，混匀，37℃孵育15min。

注意：如果需要，可延长孵育时间至 30min。

2.5 荧光显微镜下使用 490±10 nm 激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。另外，使用545nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。

注意：可以使用以下方法优化两种荧光染料的最佳工作浓度。

a) 在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育10分钟或在70%乙醇中孵育30分钟制备死细胞；

b) 用0.1-10µM的PI溶液进行死细胞染色，以得到仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。

c) 用0.1-10µM的Calcein-AM进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色。

注意事项：

1）由于 Calcein-AM 对湿度非常敏感，若是 Calcein-AM 溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。Calcein-AM 工作液必须现配现用。

2）碘化丙啶（PI）操作时一定要注意防护。若接触到皮肤，需要立即用自来水清 洗。

3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。