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升级版线粒体提取试剂盒（组织和细胞通用）Mitochondria-Cytosol Protein Isolation Kit （Upgrade Version） C0010
升级版线粒体提取试剂盒（组织和细胞通用）Mitochondria-Cytosol Protein Isolation Kit （Upgrade Version） C0010厂家直销，提供OEM定制服务！
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描述：
线粒体制备试剂盒 (Mitochondria Isolation Kit)用于从组织或培养细胞中分离线粒体和细胞胞浆成分。加入分离溶液，匀浆破碎组织细胞，经过数次800g和12000g离心，在60分钟内即可分离出完整的线粒体和胞浆成分。制备的线粒体具有很高的生物学活性，可进行各种功能研究如酶学测定，更可用于Western Blot、2D-胶、线粒体蛋白或DNA提取、蛋白质组学等研究。
严格按照说明操作，总是能制备获得高纯度线粒体。一篇方法学研究论文发现，用普利莱试剂盒制备线粒体的得率、活性、纯度优于蔗糖密度梯度离心法和Invotrogen/Pierce线粒体提取试剂盒方法。
适用：
从组织、培养细胞制备高纯度线粒体，同时分离细胞胞浆成分。
组成：
Mito Solution 100ml for 50次制备；200ml for 100次制备
储存：
−20ºC 12个月有效
操作步骤：
以下所有操作均在4ºC进行
1.组织匀浆：100~200mg新鲜组织如肝、脑、肾、心肌等，剪为0.5cm2 碎块放入小容量玻璃匀浆器内。估计组织块总体积。加入1.5ml冰预冷的Mito
Solution。用间隙严紧的研杵上下研磨组织20次。
培养细胞匀浆：800×g 5min离心收集细胞。单次提取需2-5×107个细胞。加入1.5ml冰预冷Mito Solution重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃
匀浆器内，用间隙严密的研杵研磨细胞30次。
2.将匀浆液转移到离心管中，800×g，4ºC离心5min。（胞核、膜碎片、未裂解细胞等在管底，弃去）
3.收集上清液并转移到新的离心管。再次800×g离心5min at 4ºC，弃沉淀。
4.将上清液转移到新的离心管。10,000×g离心10min 4 ºC。线粒体沉淀在管底。离心后的上清含胞浆成分，可收集用于对照实验。
5.洗涤线粒体：加入0.2ml Mito Solution，轻弹管底重悬线粒体沉淀；12,000×g离心10min 4ºC。弃上清，线粒体沉淀在管底。
6.重悬线粒体：可以用Mito Solution重悬线粒体沉淀，也可以用合适后续实验的自备缓冲液来裂解线粒体沉淀，具体用量是：约每100mg组织提取的
线粒体用50µl，约每5×107个细胞提取的线粒体用100µl。用量请根据组织或细胞类型进行微调。
7.裂解线粒体后，进行蛋白浓度测定。立即使用或−70ºC保存。
说明：
1.制备高质量线粒体的关键：第一，全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中；第二，快速，微量制备比大规模制备操作更快速，更容易
获得完整的线粒体，且得率高；第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。破碎效果与组织细胞类型有关；与组织块相
比，贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁。用1-3ml小容量玻璃匀浆器(而不是其它破碎装置)上下研磨培养细胞20-30次。玻璃匀浆器
须配套选用间隙严密的研杵，其特征是将研杵插入匀浆器套管后，可提起研杵而套管不会脱落。正确的匀浆不是旋转研杵，而是上下缓慢推拉研
杵，研杵推进和提升过程中细胞遭受压力的剧变而破碎。研磨程度可用相差显微镜进行检查当未裂解细胞在~50%即可。过度研磨会破坏线粒体，而研
磨不足将降低线粒体得率。
2.如果不得不用电动匀浆器(polytron)，可选用6500转，刀头上下进出4次共计10秒。不同的电动匀浆器性能差别甚大，除非步步监测，否则分离结果
难以预料。
3.不同的离心机必须跟据离心力g计算正确的离心转速(允许10%波动)，否则将导致不纯。
4.进行Western Blot可直接用RIPA裂解液或SDS-PAGE样品缓冲液裂解线粒体；也可先用Mito Solution重悬线粒体，再加入2x SDS-PAGE样品缓冲液。
5.Cytochrome oxidase, Monoamine oxidase, Succinate dehydrogenas, Glutamate dehydrogenase可用作线粒体的标志酶。
6.重悬线粒体：可以用Mito Solution重悬线粒体沉淀，也可以用合适后续实验的自备缓冲液来裂解线粒体沉淀具体用量是：约每100mg组织提取的线
粒体用50µl，约每5×10^7个细胞提取的线粒体用100µl。用量请根据组织或细胞类型进行微调。
7.裂解线粒体后，进行蛋白浓度测定。立即使用或−70ºC保存。
目前，使用我公司线粒体/胞浆蛋白制备试剂盒发表的SCI英文论文已有多篇，以下供参考：
1、 Shangguan W J, Li H, Zhang Y H. Induction of G2/M phase cell cycle arrest and apoptosis by ginsenoside Rf in human osteosarcoma MG‑63 cells through the mitochondrial pathway[J]. Oncology reports, 2014, 31(1): 305-313.
2、 Zhou X, Zhao Y, Fang Y, et al. Hes1 is upregulated by ischemic postconditioning and contributes to cardioprotection[J]. Cell biochemistry and function, 2014, 32(8): 730-736.
3、 Zhang P, Pan H, Wang J, et al. Telomerase activity-independent function of telomerase reverse transcriptase is involved in acrylamide-induced neuron damage[J]. Biotechnic & Histochemistry, 2014, 89(5): 327-335.
4、 Zhou X L, Wan L, Xu Q R, et al. Notch signaling activation contributes to cardioprotection provided by ischemic preconditioning and postconditioning[J]. J Transl Med, 2013, 11: 251.
5、 Zhang F, Zhang L, Sun L, et al. Effects of Fluid Shear Stress on Expression of Smac/DIABLO in Human Umbilical Vein Endothelial Cells[J]. Current Therapeutic Research, 2013, 74: 36-40.
6、 Zhao G, Ma H, Shen X, et al. Role of glycogen synthase kinase 3β in protective effect of propofol against hepatic ischemia–reperfusion injury[J]. Journal of Surgical Research, 2013, 185(1): 388-398.
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10、 Li W, Zhang J, An W. The conserved CXXC motif of hepatic stimulator substance is essential for its role in mitochondrial protection in H 2 O 2-induced cell apoptosis[J]. FEBS letters, 2010, 584(18): 3929-3935.
11、 Fang N X, Yao Y T, Shi C X, et al. Attenuation of ischemia–reperfusion injury by sevoflurane postconditioning involves protein kinase B and glycogen synthase kinase 3 beta activation in isolated rat hearts[J]. Molecular biology reports, 2010, 37(8): 3763-3769.
12、 Zhao C Q, Zhang Y H, Jiang S D, et al. Both endoplasmic reticulum and mitochondria are involved in disc cell apoptosis and intervertebral disc degeneration in rats[J]. Age, 2010, 32(2): 161-177
13、 Yin Q, Jin P, Liu X, et al. SDF-1α inhibits hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis in mesenchymal stem cells through PI3K/Akt and ERK1/2 signaling pathways[J]. Molecular biology reports, 2011, 38(1): 9-16.
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