组织细胞 辅酶Ⅱ(NADP+/NADPH)检测试剂盒(WST-8法) E2035周三品牌日,周周有惊喜!
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组织细胞 辅酶Ⅱ(NADP+/NADPH)检测试剂盒(WST-8法) E2035
产品简介
NADP/NADPH检测试剂盒(NADP/NADPH Assay Kit)是一种特异灵敏的检测总烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的试剂盒。NADP在细胞内以两种化学型存在,NADP+是氧化型,NADPH是还原型。在氧化还原反应中,NADP+作为氢和电子的受体,NADPH作为氢和电子的供体,在糖酵解等生理过程中发挥重要作用。
本试剂盒利用NADPH与CCK-8试剂反应生成NADP+和甲赞(Formazan),通过测定甲赞450nm吸光度定量测定NADPH浓度。在该检测反应中,同时加入葡萄糖-6-磷酸(Glucose-6-phosphate, G-6-P)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase, GDH),可以将生成的NADP+还原为NADPH,使检测反应成为循环反应,在G-6-P、CCK-8和GDH过量的条件下,生成的甲赞与NADP+和NADPH总量(NADP)成正相关,从而定量检测NADP浓度。在样本经过加热分解NADP+后,可以定量检测NADPH浓度。
检测反应示意图如下:
本试剂盒具有良好的检测线性,检测NADP/NADPH的线性范围为0.078-5μM,灵敏度≤0.078μM。
本试剂盒能够检测细胞培养上清、细胞裂解上清、组织裂解上清、血浆和血清中的NADP/NADPH。
试剂盒组成
组份名称 |
规格 |
数量 |
储存 |
Lysis Buffer |
50ml/瓶 |
1 |
-20℃ |
NADP/NADPH Assay Buffer |
5 ml/瓶 |
1 |
-20℃ |
G-6-P Solution |
0.6 ml/管 |
1 |
-20℃ |
GDH Solution |
60 μl/管 |
1 |
-20℃ |
CCK-8 Solution |
1 ml/管 |
1 |
-20℃ |
NADPH Standard (1mM) |
250 μl/管 |
1 |
-80℃ |
储存条件
干冰运输,收到试剂盒后按将试剂盒不同组分按上述温度储存,有效期12个月。
注意事项
1. 每次测定时利用标准品制作标准曲线。
2. 实验过程中,除裂解液和检测缓冲液外,其它试剂请置于冰上。
3. 本产品仅限专业人员用于科学研究,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品。
测定前准备
1. 样品的准备
1.1 细胞裂解上清的准备:将需要测定的细胞(1×106-1×107)收集到2ml的离心管中,4℃、300g离心5分钟,弃去上清,然后加入200μl的Lysis Buffer,冰浴裂解30min,4℃、10000g离心10分钟,收集上清。
1.2 组织裂解上清的准备:将需要测定的组织(20-50mg)收集到玻璃匀浆器或自动匀浆管中,然后加入0.5ml的Lysis Buffer,匀浆1min,4℃、10000g离心10分钟,收集上清。
1.3 NADPH测定样品的准备:将上述样本,60℃孵育30min,使NADP+分解后,用于NADPH测定。
2. 试剂盒的准备
NADP/NADPH检测工作液的配制:根据待测样品数参考下表配制适当量的NADP/NADPH检测工作
液,表中试剂按比例混合后即为NADP/NADPH检测工作液。
|
1个样品 |
10个样品 |
50个样品 |
NADP/NADPH Assay Buffer |
34.5 μl |
0.345 ml |
1.725 ml |
G-6-P Solution |
5 μl |
50 μl |
250 μl |
GDH Solution |
0.5 μl |
5 μl |
25 μl |
CCK-8 Solution |
10 μl |
100 μl |
500 μl |
3. 标准品的准备
在1.5 ml离心管中,加入995μl纯水或Lysis Buffer,再取5μl的1mM浓度NADPH标准品加入离心管中配制5μM浓度NADPH标准品;然后取另外6根1.5 ml离心管,分别加入500μl或Lysis Buffer,再吸取500μl的5μM浓度NADPH标准品依次倍倍稀释为2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078μM浓度。
测定方法
1. 参考下表,使用透明96孔板,依次加入标准品或样品、NADP/NADPH检测工作液,混匀,室温孵育10-20分钟。
|
空白对照孔 |
标准曲线孔 |
样品孔 |
纯水或Lysis Buffer |
50 μl |
─ |
─ |
NADPH标准品 |
─ |
50 μl |
─ |
样品 |
─ |
─ |
50 μl |
NADP/NADPH检测工作液 |
50 μl |
50 μl |
50 μl |
2. 待反应完成后,利用酶标仪测定相对发光强度450nm波长的吸光度,如果样本中NADP/NADPH浓度偏低,可以适当延长反应时间。
数据处理
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