细胞核制备试剂盒

描述：

在破碎组织细胞时加入活化剂，帮助裂解细胞，反复振荡或使用剪切力释放细胞核，然后在温和条件下低速离心收集细胞核。在30-60分钟内完成，无需特殊设备，简便易行，重复性好。适用于从组织块、贴壁或悬浮培养细胞制备完整高纯度细胞核。制备的细胞核仍然保持其在细胞内时所具有的形状和大小，是进行细胞核相关实验、研究蛋白核转位、DNA-蛋白相互作用、以及进行WBt和免疫共沉淀的理想材料。

组成：

100mlBuffer1（CER）,5ml ReagentA,100ml Buffer2（NER）,for100preparations。

储存：

短期4ºC。可分装出一部分−20ºC保存。

适用：

从组织块、贴壁或悬浮培养细胞制备完整的细胞核。

Step-1A培养细胞裂解1.贴壁细胞需消化或刮下细胞，悬浮细胞可直接离心，PBS洗涤，800×g5min收集细胞。计数，并估计细胞沉淀的体积。每次提取需要1-2107个细胞。通常每1×107个细胞的沉淀体积约100µl。2.加入10倍于细胞沉淀体积的1ml冰预冷的Buffer1（CER），振荡重悬细胞。冰水浴5分钟。3.加入1/20体积约50µlReagentA，剧烈振荡混合。冰水浴5分钟。再次剧烈振荡。4.将细胞裂解物3次或多次通过22号针头剪切，或用小容积间隙紧密的玻璃匀浆器上下研磨20次。在相差显微镜下检查游离的核应达到95%而未裂解细胞应少于5%。否则继续剪切或研磨。

Step1-B组织块破碎和裂解1.称取100-200mg新鲜组织如肝脏、脑，PBS冲洗，加入1ml（约10倍组织体积）冰预冷的Buffer1（CER）。2.用间隙严密的研杵上下研磨培养上下研磨组织10次。冰水浴5分钟。3.加入1/20体积约50µlReagentA，混合。冰水浴5分钟。剧烈振荡。4.在相差显微镜下检查游离的核应达到95%而未裂解细胞应少于5%，否则继续剪切或研磨。5.如有必要，用滤纸过滤组织匀浆裂解物。

Step2细胞核制备1.将组织或细胞匀浆物转移到离心管。1000×g离心3min4ºC沉淀细胞核，弃上清。2.用10倍于胞核体积(~0.5ml)Buffer2(NER)重悬核。2000×g离心10minat4ºC，弃上清。3.重复步骤2洗涤细胞核。在相差显微镜下胞核应游离分散在清亮背景下存在颗粒物质表明细胞质成分残留；核聚集表明存在粘连性的细胞骨架或染色质，通常由于细胞匀浆破碎不足或起始细胞数太多。4.弃上清。用50-100µl适宜的缓冲液重悬细胞核，进行下一步实验。或将胞核沉淀直接−70ºC保存，注意解冻后会有部分核在融化过程中破裂。

注意：

1.破碎细胞是关键环节。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁细胞较难破壁。组织细胞裂解物3次或多次通过22号针头剪切破碎细胞，或用小容积玻璃匀浆器、间隙紧密的研杵上下研磨培养20次。用相差显微镜检查未裂解细胞应少于5%。否则继续剪切或研磨。2.基于梯度密度离心原理，以离心力g计算正确的离心速度十分重要。3.加入何种缓冲液重悬细胞核，取决于用户后续的实验。如做WB可用RIPA裂解缓冲液。4.进行WesternBlot和2D-胶电泳，可先用小体积的水重悬核沉淀，然后加入样品缓冲液，如果直接用含SDS的缓冲液裂解核将释放大量粘稠的DNA使样品难以分散。反复加热变性有助于DNA断裂，可通过细针头反复抽吸打断DNA。免疫沉淀时可直接加入IP缓冲液。