PCR产物回收试剂盒（PCR DNA Extraction Kit） D1502

描述：

本试剂盒采用优化的缓冲体系和硅胶柱纯化技术，可从各种浓度的TAE或TBE琼脂糖凝胶中回收70bp-20kb的DNA片段，溶胶后转入DNA吸附柱在高盐条件下直接离心即可专一性吸附DNA，去除其它杂质。试剂盒也可直接从PCR产物、酶促反应体系或其它各种方法获得的DNA粗制品中纯化DNA片段，同时除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子及寡核苷酸引物等杂质。可在10-15min完成纯化工作。纯化的的DNA可直接用于连接、转化、酶切、体外转录、PCR、测序、微注射等分子生物学研究。

适用：

各种浓度的TAE或TBE琼脂糖凝胶；PCR产物、酶促反应体系或其它各种方法获得的DNA粗制品。回收片段范围为70bp - 20kb。

组成(100次)：

DNA结合液 80ml

漂洗液 2*20ml（使用前按瓶上指定体积加入无水乙醇）

洗脱缓冲液 20ml

DNA吸附柱 100个

滤液收集管 100个

储存：

4^oC或室温

效期：

一年

操作步骤：

注意：首次使用前按漂洗液试剂瓶标签所示，每20ml加入80ml的无水乙醇，室温保存。

凝胶回收方案

1. DNA电泳结束后，在紫外灯下快速切下含目的DNA片段的凝胶，建议用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，并尽量去除多余凝胶。称取凝胶重量(去除空管重量)，100mg凝胶等同于100μl体积，作为一个凝胶体积。

2. 加入等倍体积DNA结合液。50~ 55℃水浴7 - 10min，根据凝胶大小适当调整时间，确保凝胶块完全溶解。水浴期间颠倒混匀2次加速溶胶。

（注意DNA结合液加入1-3倍体积不影响DNA回收率。若回收小于或等于100bpDNA片段时，加入3倍体积DNA结合液，水浴溶胶后，再加入1倍凝胶体积异丙醇，混匀后再按第3步进行操作）

3. 短暂离心收集管壁上的液滴。将DNA吸附柱置于滤液收集管中，把≤700µl溶胶液转移至吸附柱中，12,000rpm(13,400×g)离心30- 60sec。若溶胶体积大于700µl，把吸附柱置回收集管中，剩余的溶胶液转移至吸附柱中，12,000rpm(13,400×g)离心30 - 60sec。

4. 弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入300µlDNA结合液至吸附柱中。静置1min。12,000rpm(13,400×g)离心30 - 60sec。

5. 弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入700µl漂洗液 (已加入无水乙醇)至吸附柱中。12,000 rpm(13,400×g)离心30 - 60sec。

注意：请沿吸附柱壁四周加入漂洗液，或加入漂洗液后盖盖颠倒混匀2 - 3次有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。

6. 重复步骤5，注意：两次使用漂洗液冲洗能确保盐份被完全清除，消除对后续实验的影响。

7. 弃滤液，把吸附柱置回收集管中。12,000 rpm(13,400×g)离心2 min。

8. 将吸附柱置于在1.5 ml灭菌的离心管中，加入20 - 30 µl 洗脱缓冲液至吸附柱中央，放置2 min。12,000 rpm(13,400×g)离心1 min。弃去吸附柱，把DNA保存于-20℃。

注意：若需要获得最高产量，建议将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复第8步进行二次洗脱。回收大于 3 KB的片段时，建议将Elution Buffer预热至55℃以提升回收效率。

PCR反应液回收方案

该方案适合于从PCR产物，酶促反应液或粗制的DNA(包括基因组DNA)中回收纯化DNA。该方案可高效地去除各种核苷酸，引物，引物二聚体，盐分子，酶等杂质。

1. 短暂离心PCR产物，酶促反应液或粗制DNA产物(包括基因组DNA)。用移液枪测量其体积并转移至灭菌的1.5 ml或2 ml离心管中。若样品体积小于100 µl，用灭菌水补充至100 µl。高浓度的基因组DNA最好用灭菌水稀释至300 µl，以提高回收效率。

2. 加入5倍体积的DNA结合液，颠倒或涡旋混匀。若需回收小于100 bp DNA片段，需再加入1.5倍体积(样品+DNA结合液的体积)的无水乙醇。

3. 将吸附柱套在收集管中。把≤700 µl溶胶液转移至吸附柱中。10,000 rpm离心30 - 60 sec。若混合液体积大于700 µl，把吸附柱置回收集管中，剩余的溶液转移至吸附柱中，12,000 rpm离心30 - 60 sec。

4. 后续步骤按凝胶回收方案第5 - 8步进行操作。

注意事项：

1. 首次使用前按漂洗液试剂瓶标签所示，加入80 ml的无水乙醇稀释，于室温保存。

2. 若低温储存时，DNA结合液容易产生沉淀，使用前可室温放置一段时间，必要时可于37℃水 浴锅预热至沉淀完全溶解，混匀后再使用。

3. 提前将水浴锅温度设至50 ~ 55℃。

4. 在步骤1中，将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶溶化时间从而提高回收率(线型DNA 长时间暴露在高温条件下易于水解)。勿将含DNA的凝胶长时

间地暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA造成的损伤。

5. 在步骤2中凝胶必须完全溶化，否则将严重影响DNA回收率。

6. 将洗脱缓冲液或去离子水加热至55℃，有利于提高DNA洗脱效率。DNA分子呈酸性， 建议在2.5 mM Tris-HCl，pH 7.0 - 8.5洗脱液中保存。

常见问题与解决方案:

DNA回收率低

琼脂糖凝胶未完全溶化：尽可能去除不含目的片段的琼脂糖，溶胶过程间隔性的摇晃促进凝胶充分溶化，仔细检查确保无固体琼脂糖残留。

回收片段过小：小于或等于100 bp片段时，加入1倍体积的异丙醇。

试剂准备有误：漂洗液需加入乙醇稀释或乙醇体积不准确(乙醇浓度需控制在80%)。

洗脱效率低：将漂洗液预热至55℃，并重复二次洗脱。

下游结果不理想

盐污染：确保用漂洗液洗脱两次；此外沿吸附柱管壁四周加入漂洗液，或加入漂洗液后盖盖颠倒混匀2 - 3次有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。

琼脂糖残留：尽可能去除不含目的片段的琼脂糖，溶胶过程间隔性的摇晃促进凝胶充分溶化，仔细检查确保无固体琼脂糖残留。

洗脱产物中有ssDNA：将洗脱产物95℃加热2 min，缓慢冷却至室温，使单链DNA重新退火即可。