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组织细胞丙二醛(MDA)检测试剂盒 Liquid Sample Malondialdehyde (MDA) Assay Kit (TBA method) E2019
  • 品  牌:

    普利莱
  • 货  号:

    E2019
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描述:组织细胞丙二醛(MDA)检测试剂盒是一种灵敏简单的检测脂质过氧化产物丙二醛的试剂盒。丙二醛(Malondialdehyde, MDA)是一种生物体脂质氧化的天然产物,一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列包括MDA在内的复杂化合物,通过检测MDA的水平可评价脂质氧化的水平,因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标。

本试剂盒是一种基于MDA和硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)在较高温度和酸性环境中反应生成红色MDA-TBA加和物,MDA-TBA加和物在535nm波长具有最大吸收,据此可以通过比色法进行检测。另外MDA-TBA535nm波长激发光激发,在553nm波长发出荧光,因此,可以通过荧光法检测MDA浓度。荧光法相对比色法灵敏度提高一个数量级。

反应示意图如下:

试剂盒以比色法检测线性范围为1.56-50μM,灵敏度≤1.56μM;荧光法检测线性范围为0.156-5μM,灵敏度≤0.156μM

适用:本试剂盒能够检测动物组织、培养细胞等样本中MDA含量。

组成:

组份名称

规格

数量

组织细胞裂解液

50ml

1

MDA标准品(1mM)

200μl/管

1

TBA

50mg/管

1

TBA配制液

7.5ml/瓶

1

SDS溶液

12ml/瓶

1

BHT溶液(100×

1ml/管

1


储存条件:-20℃储存,一年有效。TBA配制成溶液后,可4℃避光储存一周。SDS溶液使用前,请恢复至室温并彻底溶解后使用,首次使用后4℃储存即可。

需要而未提供的试剂及器材

1. 超纯水

2. 0.1M PBS(PH7.0-7.4)EDTA

3. 系列可调节量程移液器及吸头

4. 干净的试管、离心管及96孔板

5. 酶标仪

操作步骤:

1. 样品的准备

1.1 细胞样品的准备:收集约2×1062×107个新鲜细胞,PBS洗涤细胞一次,离心收集细胞,吸尽上清加入300 μl的中等强度RIPA裂解液(提前加入100×的抗氧化剂BHT)冰浴裂解30分钟。4℃,10000g离心10分钟。取上清用于MDA定量测定。不立即测定的样品可以-70℃保存。对于细胞量差别大的样本请利用BCA蛋白定量法测定细胞裂解液上清中总蛋白浓度,以校正MDA测定结果。

1.2 组织样品的准备:利用含1mM EDTA的PBS灌流或漂洗组织,去除组织中的血液,然后取约10 mg组织,加入500 μl的中等强度RIPA裂解液(提前加入100×的抗氧化剂BHT),冰浴匀浆。4℃,10000g离心10分钟。取上清用于MDA定量测定。不立即测定的样品可以-70℃保存。另外请利用BCA蛋白定量法测定组织裂解液上清中总蛋白浓度,以校正MDA测定结果。

2. 试剂盒的准备

2.1 TBA液的配制:将本试剂盒提供的1管50 mg TBA倒入50ml离心管中,再加入7.5ml TBA配置震荡2分钟溶解TBA,然后加入17.5ml的纯水,彻底溶解TBA,可以超声助溶,即为TBA液,浓度为2mg/ml。

3. 标准品的准备

比色法标准品的配制:在1.5ml离心管中,加入950μl纯水,再取50μl的1 mM浓度MDA标准品加入离心管中配制50μM浓度MDA标准品;然后取另外51.5ml离心管,分别加入500μl纯水,再吸取500μl的 50μM浓度MDA标准品依次倍倍稀释为2512.56.253.121.56μM浓度。

荧光法标准品的配制:在1.5ml离心管中,加入1ml纯水,再取5μl的1mM浓度MDA标准品加入离心管中配制5μM浓度MDA标准品;然后取另外51.5ml离心管,分别加入500μl纯水,再将500μl的5μM浓度MDA标准品依次倍倍稀释为2.51.250.6250.3120.156μM浓度。

测定方法

1. 1.5 ml离心管中,按下表进行配制:

空白管

标准品管

样品管

对照管

纯水

100μl

200μl

标准品

100μl

待测样品

100μl

100μl

SDS溶液

100μl

100μl

100μl

100μl

TBA溶液

200μl

200μl

200μl

一般情况下,对照管每批只需做1-2支,若样本不存在溶血、脂血现象,对照管可以不做。

2. 将离心管置于95℃水浴或金属浴反应30分钟,然后冰浴冷却至室温。

3. 10000g离心10min,取200 μl上清溶液,测定吸光度(535nm)或发射的荧光强度(ex535nm-em553nm)。

数据处理

利用MDA标准品浓度为横坐标,吸光度值或发射荧光值为纵坐标制作标准曲线,并获得横纵坐标之间的函数关系式,然后利用标准曲线和各样品的吸光度值或发射荧光值计算样品的MDA浓度。细胞裂解上清和组织匀浆上清,可以计算每毫克蛋白中的MDAMDA标曲测定结果如下图所示:

参考文献

1. Armstrong, D., and Browne, R. (1994). Free Radicals in Diagnostic Medicine. 366: 43-58.

2. Armstrong, D., et al. (1998). Free Radicals and Antioxidant Protocols. 108:315-324.

3. Yagi, K. (1998). Free Radicals and Antioxidant Protocols. 108: 101-106.

注意事项

1. 血红蛋白对测定有一定干扰,请尽量避免血浆和血清制备过程中的溶血。

2. TBA配制成溶液后不够稳定,要在4℃避光储存,一周内用完。

3. 初次使用试剂盒时,粉末试剂和小体积液体试剂请适当离心后使用。

4. 本产品仅限专业人员用于科学研究,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品。

5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

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