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细胞膜蛋白提取试剂盒 P1203
  • 品  牌:

    普利莱
  • 货  号:

    P1203-50
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  • 价格:560.00-960.00
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细胞膜蛋白提取试剂盒Mem Preparation Kit P1203

描述:

本试剂盒能够从哺乳动物新鲜或冻存的组织块、贴壁或悬浮细胞中制备细胞膜与胞内质膜组分。其独特的试剂成分与优化的制备方案使胞膜制备过程简单易行,无需特殊设备和超速离心,可在1小时内完成。应用本试剂盒制备的胞膜是细胞膜和细胞器膜如线粒体、内质网及质膜的混合物。制备得到的产物纯度可胜任后续的免疫沉淀、蛋白印迹、2-D gel、酶活性检测和受体分析等实验。

组成:

(以下是50次规格用量)

CER (Cytosol Extraction Reagent)       25ml

MER (Membran Extraction Reagent)       2.5ml

Suspension Buffer 10ml

储存:

各组分4 oC 有效期12个月

操作步骤:

一. 样本预处理:

收集细胞:(在每一次制备过程中,使用等量的细胞数将明显提高后续检测结果的一致性,因此建议在制备前对细胞准确计数)

1. 贴壁细胞:PBS缓冲液冲洗细胞平皿,用胰蛋白酶消化细胞。800g离心5-10分钟,弃上清,用PBS缓冲液重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。

2. 悬浮细胞:800g离心5-10分钟,弃上清。用PBS缓冲液重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。

以下制备过程要在4 oC或冰水浴中进行

二. 组织细胞匀浆裂解

1. 细胞匀浆裂解

向每1x107个细胞或每100µl(细胞离心后的体积)细胞沉淀中加入500µlCER试剂,震荡重悬,冰浴2分钟。将细胞悬液转移到冰预冷的玻璃匀浆器内,在冰水浴中上下手动匀浆20-30次。

注意:此破碎细胞步骤为关键环节。要使用1-3ml小容积玻璃匀浆器,须选用间隙严密的研杵,其特征是将研杵插入匀浆器套管后,可提起研杵而套管不会脱落。有效研磨是上下推拉而不是旋转。破碎效果与细胞类型有关,可在相差显微镜下检查,未裂解细胞应小于5%

2. 组织块匀浆裂解:

250mg哺乳动物新鲜或-80 oC冻存组织块放入冰预冷的玻璃匀浆器内,加入500µlCER试剂。用研杵捣碎组织块,上下手动匀浆20次,冰浴10分钟,然后上下手动匀浆7次。

注意:与培养细胞特别是贴壁细胞相比,组织块中的细胞在匀浆时较易破碎,因而并非必须选择间隙严密的研杵。如果研杵与套管过于严密,会使组织匀浆困难,可选用研杵与套管稍松的匀浆器,破碎效果与组织细胞类型有关,可在相差显微镜下检查,未裂解细胞应少于5%

三、 粗提物制备:

取约500µl裂解物,转移到新的离心管中,800g ,4oC离心5分钟。上清为胞膜-胞浆混合物。

四、 胞膜胞浆制备:

1)将步骤三获得的上清转移到新的离心管中,估计上清的体积; 2)加入上清液1/10体积的MER与上清液混合,冰浴5分钟;314,000rpm4oC离心

30分钟;4)沉淀为胞膜组分,含有细胞膜和亚细胞器碎片,可短暂离心除尽液体,用50-100µl Suspension Buffer重悬备用或用RIPA裂解胞膜;做WB

时膜蛋白分子量100KD以上的建议用较强的蛋白提取试剂如加强的RIPA,便于获取溶解度低的膜蛋白,具体方案根据试验目的确定。

说明:

1.Suspension Buffer 不含去垢剂,重悬于Suspension Buffer 中的胞膜或胞核组分呈不溶解状态是正常的,用户可用自备溶液重悬胞膜或胞核成

分。如果进行蛋白印迹、2-D get等实验,用户可用SDS上样缓冲直接裂解细胞膜或细胞核成分。对于进行免疫共沉淀实验来说,可用RIPA裂解液

C1053

重悬胞膜。

2.试剂盒各组分中未添加蛋白酶抑制剂,可自行选择添加

以下仅列举数篇使用普利莱P1203试剂盒发表的文章供参考。

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